סיקור: המשחק מתחיל בדיוק מהמקום שמהמשחק הראשון בסדרה נגמר, כשדזמונד מיילס עדיין כלוא בבניין של חברת "תעשיות אבסטרגו" בשנת 2012, לאחר ביצוע חיפושים בזיכרונותיו של האב הקדום שלו מימי הביניים, המתנקש אלטאיר באמצעות מכשיר הקרוי "אנימוס". "תעשיות אבסטרגו", המוצגים בתור הטמפלרים המודרניים, משתמשים בזיכרונותיו של אלטאיר על-מנת לגלות מידע אודות מיקומם של חפצים רבי-עצמה הקרויים "החלקים של עדן" (Pieces of Eden) ובהם "תפוח עדן" המוצג ככלי שבעזרתו ניתן לשלוט במחשבותיהם של בני האדם וליצור אשליות מסוגים רבים. בעקבות חשיפת-יתר לאנימוס, דזמונד החל לחוות בתופעה הקרויה "אפקט הדימום" (Bleeding Effect) המוביל לקושי בהבחנה בין הזיכרון הגנטי שלהם ובין הזיכרון בזמן-אמת. כתוצאה מכך, דזמונד קיבל את היכולת להשתמש ב"ראיית-נץ", המשותפת למתנקשים, וכך הוא ראה את ההודעות ואת הסמלים אשר אדם שכונה "Subject 16" כתב בעזרת דמו באזורים שונים בבניין אשר בו דזמונד כלוא. לוסי סטילמן, מתנקשת וחוקרת-לשעבר של "תעשיות אבסטרגו", שחררה את דזמונד והובילה אותו אל מחבוא בו היו שני מתנקשים נוספים: ההיסטוריון שון הייסטינגס (Shaun Hastings) והמומחית למחשבים רבקה קריין (Rebecca Crane). השלושה הזמינו את דזמונד לחקור את זיכרונותיו של אחד מאבותיו הקדומים מימי הרנסאנס, המתנקש אציו אודיטורה דה פירנצה, בעזרת גרסה אחרת של האנימוס אשר כונתה על ידי רבקה "אנימוס 2.0". דזמונד, אשר חוקר את זיכרונותיו של אציו המתגורר בפירנצה בהמאה ה-15, מגלה כי אביו ושני אחיו הם הקרבנות של מזימה פוליטית מסוימת, וכי לא ניתן למנוע את הוצאתם להורג בתלייה. לפני תלייתו, אביו של אציו מסר לו את מיקומה של תיבה אשר בה מונחים בגדי מתנקש וכלי התנקשות שעליו לקחת. דודו של אציו, מריו, לוקח אותו, את אחותו ואת אמו למחסה שבווילה של משפחת אודיטורה. מריו מלמד את אציו כיצד להילחם ומספק לו מידע אודות מקום הימצאם של האנשים שהובילו להוצאתם להורג של בני משפחתו. המידע הוביל את אציו לטוסקנה, לסן ג'ימיניאנו להרי האפנינים, לוונציה ולבסוף לרומא. לאורך הדרך, אציו פוגש אנשים רבים אשר מסייעים לו להמשיך את מסעו, וביניהם לאונרדו דה וינצ'י אשר מפענח את הקודקס שאלטאיר השאיר כדי ליצור למען אציו ציוד חדש. לאחר התנקשויות ברוב האנשים אשר היו מעורבים במזימה הפוליטית, אציו מגלה כי מנהיג הקונספירציה היה רודריגו בורג'ה וכי מטרתו הייתה להפיל את שלטון בית מדיצ'י בעזרתם של בית פאצי והדוג'ה של ונציה. בורג'ה מגיע לוונציה עם "תפוח עדן", החפץ שאלטאיר מצא. הוא מאמין כי הוא "הנביא" וכי הוא מיועד לגלות את ה"כספת" (The Vault) המכילה מספר "חלקים של עדן" וידע נוסף שהטמפלרים מחפשים. אציו, בעזרת בעלי הברית שלו, עוצר את בורג'ה, שלאחר מכן בורח מפניהם ללא התפוח. בעלי בריתו של אציו חושפים בפניו את העובדה כי הם מתנקשים ומצרפים את אציו אליהם. הם מציינים כי לדעתם אציו הוא "הנביא" אשר יוביל אותם אל "הכספת". אציו מפליג לוותיקן, המקום בו "הכספת" נמצאת, על-מנת לעצור את רודריגו. רודריגו משתמש באחד מ"חלקי עדן", מטה, כדי להביס את אציו ולוקח מידיו את התפוח. אציו עוקב אחריו, ומבחין בכך שרודריגו אינו מצליח לפתוח את "הכספת". הוא מאתגר את רודריגו לקרב בלי כלי נשק ומביס אותו. רודריגו מצפה שאציו ירצח אותו, אך אציו אומר שהדבר לא יחזיר את משפחתו לחיים ועוזב אותו. אציו נכנס ל"כספת", שנפתחת למענו משום שהוא "הנביא", שם הוא מוצא את מינרווה. היא מעבירה דרכו מסר לדזמונד אודות התפרצות סולרית שהתרחשה בעבר ועתידה להתרחש שנית, אלא אם דזמונד ימנע זאת. דזמונד ואציו מבולבלים מאוד מהמסר.